香紫苏醇是一种芳香化合物，属于双环二萜醇，主要用作合成天然龙涎香等香料产品和药品的原料。生产香紫苏醇的方式包括从植物提取、生物发酵等，其中构建微生物细胞工厂是高效合成香紫苏醇等高值萜类化合物极具潜力的一种方式。
近日，大连化物所合成微生物学研究组周雍进团队通过合成生物学方式高效合成了天然萜类化合物香紫苏醇。在最新的研究中，研究人员通过模块化重新调整细胞代谢路径，成功构建了多功能酵母细胞工厂，并以葡萄糖为原料在酿酒酵母中高效合成香紫苏醇，产量达到 11.4 g/L。据悉，这一产量是目前已有报道中二萜类化合物的最高产量。相关研究论文已于近日发表在 Metabolic Engineering 上。
（来源：elsevier）
官方通稿指出，通过借助转录组学和代谢流分析技术，研究揭示了二萜高效合成菌株的代谢流调控规律，为构建高效萜类合成细胞工程提供了理论指导。
本文的第一作者是该课题组已出站的博士后研究员曹选博士，通讯作者为周雍进研究员。周雍进曾赴瑞典查尔姆斯理工大学 Jens Nielsen 院士实验室从事博士后研究，并于 2017 年 1 月回到大连化物所组建实验室。目前，他实验室的主要研究方向以酵母为底盘发展合成生物技术，并将一碳和生物质资源高效转化为目标产物。
研究人员在论文中写道，总体而言，全面调整代谢路径可以构建新的代谢类型，可以用于生产多种衍生于其他关键节点代谢产物的化学物质，比如说葡萄糖 6-磷酸盐，丙酮酸和丙二醇辅酶 A。
二萜类化合物通常由植物、动物和真菌通过甲羟戊酸途径进行生物合成，主要中间体为香叶基香叶基焦磷酸。通过合成生物学方法构建微生物细胞工厂生产此类萜类化合物是一种比较新型的生产模式，也是现阶段的研究热点。
此前，二萜类化合物生产主要通过模块化方式优化基因表达设计异戊二烯类生物合成途径和二萜类合成酶。对于商业化量产而言，通过这些方式在酵母中生产化合物的产量较低，通常低于 4 g/L。产量较低的一个原因可能是代谢问题导致的二萜类化合物合成的前体乙酰辅酶 A 表达不足。
研究人员认为，通过重新调整代谢路径，有望达到一种新的平衡代谢模式，从而足量甚至过量生产目标产物。在最新的研究中，研究团队通过全新设计酿酒酵母的中心代谢路径，提高了生物合成效率，并应用于可持续生产香紫苏醇。
▲图 | 设计酵母用于可持续生产香紫苏醇，通过系统设计酵母细胞代谢以增强前体乙酰辅酶 A 和辅因子 NADPH 的供应，促进类异戊二烯途径的代谢通量，使过量生产香紫苏醇成为可能。（来源：上述论文）
在研究中，课题组首先尝试通过改造合成酶提高产量，他们在酵母基因上融合了 Tps 和 Lpps 两种合成酶，这是鼠尾草中的 I 类和 II 类二萜合成酶，生物合成香紫苏醇也是基于这两种酶实现两步酶促催化反应。数据显示，Tps-Lpps 融合可有效将香紫苏醇的产量提高 6.7 倍。然后，他们将 Tps-Lpps 的 N 端与麦芽糖结合蛋白（MBP）的一部分连接在一起，用以提高酶的稳定性，这一优化将香紫苏醇的产量提高了 43%。
▲图 | 通过设计二萜合酶提高香紫苏醇的产量（来源：上述论文）
接下来，研究团队通过系统改造细胞代谢路径增加香紫苏醇的产量，他们将整个代谢路径分为三个模块，即供应乙酰辅酶 A 的中心代谢途径、类异戊二烯生物合成途径和调节因子模块。
在研究中，为了减少繁琐的基因改造步骤，该团队通过重新调整底盘细胞的中心代谢尝试将细胞代谢从游离脂肪酸（FFA）的生物合成转化为合成二萜化合物。这一转化可以节省 18 个基因操作步骤，缩短构建基于底盘菌株构建多功能细胞工厂的时间。简言之，原位恢复了删掉的 FFA1/4，并去掉用于脂肪酸生物合成的过表达基因 FAS1/2 和 TESA，从而构建了一个可高效供应乙酰辅酶 A 和 NADPH 的底盘菌株。
研究显示，在底盘中，过表达 tHMG1、SpHMGR 和 ERG20* 基因，香紫苏醇的产量为 6.4 mg/L，比对照菌株 CXM21 提高了 5.2 倍。进一步过表达 ERG10 和 HMG2* 基因，香紫苏醇的产量为 49.1 mg/L，比对照菌株 CXM22 提高了 22 倍。与野生型相比，增强底盘细胞的中心代谢能更明显改善类异戊二烯生物的合成。
▲图 | 整体优化生产香紫苏醇的酵母代谢途径（来源：上述论文）
基于构建的底盘细胞，研究团队全面设计了类异戊二烯途径以进一步改善香紫苏醇的生物合成，通过基因拷贝增加与删除尝试提高产量。比如说，在菌株 SCX32 中，表达两个 HMG2* 基因可以将香紫苏醇产量提高到 120.3 mg/L；在菌株 SCX38 中，过表达融合基因 BTS1-PaGGPPS 使香紫苏醇产量提高到 347.4 mg/L。
研究团队还评估了优化调节因子对香紫苏醇产量的影响。比如说，删除菌株 SCX38 中的调节基因 ROX1、DOS2、VBA5、YER134C、YNR063W 和 YGR259C，并观察到菌株 SCX42 中香紫苏醇产量为 918 mg/L，较SCX38 中的产量提高 1.7 倍。
然后，通过工程菌株的代谢谱分析了每个模块对合成香紫苏醇的影响。在野生型前提下，优化类异戊二烯途径（菌株 CXM17）可提升产量至 13.4 mg/L/OD600，进一步优化调节因子（ 菌株 CXM18）可将产量提高 2.6 倍。在改造核心代谢的基础上，优化类异戊二烯通路（菌株 SCX38）和设计调控因子（菌株 SCX42）分别比菌株 CXM17 和菌株 CXM18 提高了约 2 倍。这些数据表明，这三个模块具有协同效应，可为香紫苏醇生物合成提供高效的代谢通道。进一步的数据表明，重组代谢路径对香紫苏醇的生物合成具有积极影响。
▲图 | 组合代谢模块分析工程菌株数据（来源：上述论文）
随后，研究团队还对工程菌株进行了转录组分析，数据表明，优化类异戊二烯通路对整个代谢网络有轻微影响，而设计中心代谢和调节因子会促进细胞代谢的全局调整。此外，除了中心代谢外，还有一些隐藏的基因也对外部代谢的重新调整有反应，有助于促进目标产物的生物合成。
在研究中，该团队还评估了上述方式的生产潜力，他们在摇瓶和生物反应器中对用于香紫苏醇生产的补料进行了分批发酵。
试验过程中，为避免补充组氨酸和尿嘧啶，研究团队通过补充营养不良标记（Auxotrophic Marker ）URA3 和 HIS3 构建了原养型菌株，这是一种营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表现型上与野生型相同。接下来，优化了摇瓶中的补料培养基，最佳菌株 SCX42-LAC1-OYE3-UH 的补料分批发酵产生了 11.4 g/L 的香紫苏醇，这是迄今为止文献中报道过最高的二萜化合物产量。
▲图 | 工程微生物中二萜类化合物的产生（来源：上述论文）
高滴度的香紫苏醇形成沉淀物，并附着在生物反应器内壁和电极上，通过己烷萃取和进一步旋转蒸发获得香紫苏醇粉末。通过检测分析，发现香紫苏醇粉末的纯度几乎与香紫苏醇标准品相同。
▲图 | 生产香紫苏醇菌株的补料分批发酵（来源：上述论文）
论文中还提到，该课题组已经申请了在酵母中生产香紫苏醇的专利（PCT/CN2021/138,506）。据了解，周雍进实验室已在合成脂肪酸衍生物，构建酵母细胞工厂合成天然产物，包括在萜类、酚酸类化合物生物合成方面取得了一定进展。
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