技术成果 | 鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体单重和双重qPCR诊断技术
前言
鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是两种最重要的禽致病性支原体。MG感染引起鸡的慢性呼吸道病(chronic respiratory disease,CRD),表现为呼吸道啰音、结膜炎、打喷嚏、鼻炎、鼻窦炎、气囊炎,以及引起关节滑膜炎、生长迟缓、产蛋量下降。MS能引起传染性滑膜炎、亚临床上呼吸感染和气囊炎、生长迟缓、产蛋量下降、产蛋尖端异常。MG和MS均可以通过呼吸道水平传播,也可以通过卵垂直传播。MG和MS在全球范围内广泛流行,在我国也普遍流行、感染率高且传播迅速,对家禽养殖业造成严重影响。
MG和MS的培养基营养要求高,培养成本较高,其生长较缓慢,培养时间长,临床分离培养不能作为及时检测诊断的手段。MG和MS的病原分离鉴定常常会出现因诊断延误而造成感染的加剧,因此难以通过病原分离进行鉴定。MG和MS在临床上多采用分子生物学和血清学检测进行检测诊断。MG和MS在临床症状、传染途径、分离培养难度等方面多有类似,临床上往往需要进行鉴别诊断。
研究背景
虽然对MG和MS的综合防控及净化需求日益增加,但是一直以来,对应的检测诊断技术支撑尚不能做到早期诊断的可靠、稳定的鉴别诊断。MG和MS的单重和双重实时荧光定量PCR(qPCR)诊断方法有建立,但是由于不断有新的临床分离株及其近源支原体菌株的分离,原有检测靶标的特异性和保守性受到严重的挑战,导致很多诊断方法往往特异性不足或敏感性不够,且尚未形成新兽药注册的商品化检测试剂盒,这也增加了禽支原体病综合防控与净化技术体系建立的难度。
本团队长期致力于MG和MS的综合防控与净化研究,基于丰富的储备临床菌株和GenBank的全基因组测序结果,经比较基因组学研究确定了MG和MS保守性和特异性更优的诊断靶标,并分别开发了MG和MS单重和双重qPCR诊断检测试剂盒。已完成实验室研究,可联合开展临床试验与注册申报。
产品简介
本试剂盒采用qPCR方法,用于禽喉头拭子、上颚裂拭子、气管拭子、泄殖腔拭子等MG和MS定植和排毒部位的拭子样品,禽呼吸道、关节组织样本,禽胚,环境样品及培养物中的MG和MS的菌种鉴定。
MG单重qPCR检测试剂盒
适用范围:禽养殖场MG阳性率检测,流行病学调查,综合防控效果评估,支原体分离菌种鉴定等。
MS单重qPCR检测试剂盒
适用范围:禽养殖场MG阳性率检测,流行病学调查,综合防控效果评估,支原体分离菌种鉴定等。
MG和MS双重qPCR检测试剂盒
适用范围:禽养殖场MG和MS阳性率检测,流行病学调查,综合防控效果评估,支原体分离菌种鉴定等。
产品特点
特异性好。通过比较基因组学分析选择相比现有靶标在特异性和保守性更优的检测靶标,建立的qPCR检测方法,与其它常见病原无交叉反应。双重qPCR检测方法相比单重qPCR检测方法,在检测MG和MS混合样本时无交叉干扰。
图1 MG单重qPCR检测试剂盒与MS单重qPCR检测试剂盒的特异性检测结果
图2 MG和MS双重qPCR检测试剂盒的特异性检测结果
灵敏度高。以基因组DNA为模板,最低可以阳性检测1拷贝/反应的样品,且100%阳性检测的最低拷贝为5拷贝/反应。MG和MS双重qPCR检测试剂盒相比MG和MS单重qPCR检测试剂盒没有降低检测敏感性。
图3 MG单重qPCR检测试剂盒与MS单重qPCR检测试剂盒的检测不同拷贝数模板的扩增曲线和标准曲线
图4 MG和MS双重qPCR检测试剂盒的检测不同拷贝数模板的扩增曲线和标准曲线
检测试剂盒已用于全国多省各种鸡场的流行病学调查。例如,下图结果显示5个不同品种鸡各1养殖场的MG和MS阳性率。由于不同场的原有综合防控措施不同,不同场的MG和MS的阳性率有较大差别,因此,根据检测结果,不同场的可以根据现有MG和MS的阳性率有侧重的制定MG和MS的综合防控措施。
图5 MG和MS双重qPCR检测试剂盒检测5个不同品种鸡各1养殖场的MG和MS阳性率

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